操作指南(以下是SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)。
1.接种骨髓间充质干细胞:取对数生长期的细胞,按照2×104cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中,于37℃,5% CO2培养环境下培养至融合度60-70%,弃掉上清,加入成骨诱导分化培养基。
2.细胞分化诱导:每2-3天更换成骨诱导培养基,于37℃,5% CO2培养环境下培养,并注意观察细胞形态变化(一般约14~28天左右)。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况,决定终止细胞诱导的时间,进行染色鉴定。
3.细胞固定:吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次,弃去后取适量 4% 中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30-60 min,弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。
4.茜素红染色:加入适量茜素红染液染3~5min,吸去茜素红染液,用 1×PBS 清洗两次,并加入适量 1×PBS 避免细胞干燥。
5.诱导评估:显微镜下观察成骨染色效果,并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时,钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。
6.半定量分析:显微观察结束后,弃上清,加入氯化十六烷基吡啶溶液,室温下孵育15~60min溶解矿化结节(茜素红),然后在562 nm处检测上清的OD值。