操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 制备染色液
1.1 配置储存液: 在高质量无水 DMSO 中制备浓度为 1-10 mM 的 AM 酯储存液;
【注】乙酰氧基甲基酯 (AM) 易吸潮,冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。开封前请将其短暂离心,以保证粉末落入管底。
1.2 配置工作液:用合适的缓冲液 (如:无血清和酚红的培养基或 PBS) 稀释储存液,配制浓度为 1-10 μM 的工作液。
【注】 1. AM 酯染色工作液制备时,有时需要往储存液中加入适量的 20% Pluronic F-127 溶液,以增强 AM 探针的水溶性。
2. Pluronic F-127 可以防止 AM 探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但 PluronicF-127 可降低 AM 探针的稳定性,因此只建议在配制工作液时加入,不建议加入储存液长期保存。
3. 请根据实际情况调整工作液浓度,现用现配,避免反复冻融。
2. 细胞染色
2.1 悬浮细胞:经 4°C、1000g 离心 3-5 分钟,弃去上清液,使用 PBS 或其他缓冲液清洗两次,每次 5 分钟;
2.2 贴壁细胞:使用 PBS 或其他缓冲液清洗两次,加入胰酶消化细胞,消化完成后经 1000g 离心 3-5 分钟;
2.3 加入染料工作溶液重悬细胞,室温或低于室温条件下避光孵育 20 分钟-2 小时。不同细胞最佳孵育时间不同,请根据具体实验需求自行摸索;
【注】1. AM 酯类染料在大部分细胞中的推荐工作浓度为 4-5 μM,具体使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性,建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度;
2. 若使用含血清的培养基,血清内酯酶会降解 AM,从而降低染料加载效果;而含酚红培养基会使本底值略偏高,建议加入染色工作液前,对细胞清洗 2~3 次;
3. 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
2.4 孵育结束后,经 1000g 离心 5 分钟,去除染色液,加入 PBS 或其他缓冲液清洗 2-3 次,去除残留探针;
2.5 室温再孵育 30 分钟以保证细胞内AM的完全去酯化。
3. 显微镜检测:Fura-2 AM 的最大激发/发射波长为 336/515nm。
注意事项:
1. 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。