Fluo-4 AM 穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4 以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4 AM 是一种常用的检测细胞内 Ca²⁺ 浓度的探针。

Fluo-4 是一种将 Fluo-3 结构中的 Cl^- 替换成 F^- 的钙荧光探针。由于将 Cl^- 替换成了电子吸引力更强的 F^-，它的最大激发波长会向短波长方向偏离 10 nm 左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4 的荧光强度比 Fluo-3 更强。

染料/荧光试剂

Fluo-4 AM 是一种荧光染料 (λ_ex=494 nm，λ_em=516 nm)。预装 Fuo-4 AM，可以观察到非常明亮的荧光图像。在使用 Fluo-3 AM 加载细胞进行的平行实验中，得到的荧光图像虽然在这种情况下清晰可辨，但不太亮 ^[1]。

操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改)

1. 用无水 DMSO 溶解 Fluo-4 AM，配制成 2 mM 的储液 (将 50 µg Fluo-4 AM 溶于 22.8 µL 无水 DMSO 中)。

2. 用 PBS 或 HBSS 稀释 Fluo-4 AM 储液，制备 4 μM 的 Fluo-4 AM 工作液。

【注】：推荐工作液浓度为 4-20 μM。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上使用最低探针浓度，可从 4 μM 开始摸索。

3. (可选) 如果 Fluo-4 AM 进入细胞的效果不好，可向 Fluo-4 AM 溶液中加入适量 20% Pluronic F-127 溶液， 防止 Fluo-4 AM 在缓冲液中聚集并促进 Fluo-4 AM 进入细胞，Pluronic F-127 终浓度控制在 0.04-0.05%。

【注】：

(1) 20% (w/v) 的 Pluronic F-127 DMSO 母液配制：100 mg Pluronic F-127 中加入 0.5 mL DMSO，配制成 20% (w/v) 的 DMSO 母液。溶解需要在 40-50℃ 加热 20-30 分钟。溶解后室温保存，勿冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

(2) Pluronic F-127 可降低 Fluo-4 AM ester 的稳定性， 因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储液中。

4. 取出预培养的细胞，除去培养基，使用 PBS 或 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。

5. 去除缓冲液，将 Fluo-4 AM 工作液加入细胞中，在 37℃ 培养 10-60 分钟。

【注】：如果首次实验不能确定孵育温度和时间，建议尝试 37℃ 孵育 20 分钟，观察荧光效果。若细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。

【注意事项】

如果使用含有血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM ester 体，从而降低 Fluo-4 AM 进入细胞的效果。另外，含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，加工作液前应尽量去除残留培养基。