操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 制备染色液
(1) 配置储存液: 使用 DMSO 溶解 Dihydrorhodamine 123 (DHR 123),配置浓度为 1-10 mM 的储存液。
【注】:未使用的储存液分装后在 -20℃ 或 -80°C 避光保存,避免反复冻融。
(2) 配置工作液: 用合适的缓冲液 (如: 无血清培养基或 PBS) 稀释储存液,配制浓度为 1-10 μM 的工作液。
【注】:请根据实际情况调整工作液浓度,现用现配。
2. 细胞悬浮染色
(1) 悬浮细胞:经 4°C、1000g 离心 3-5 分钟,弃去上清液,使用 PBS 清洗两次,每次 5 分钟。
(2) 贴壁细胞:使用 PBS 清洗两次,加入胰酶消化细胞,消化完成后经 1000g 离心 3-5 分钟。
(3) 加入 DHR 123 工作溶液重悬细胞,室温避光孵育 5-30 分钟。不同细胞最佳孵育时间不同,请根据具体实验需求自行摸索。
(4) 孵育结束后,经 1000g 离心 5 分钟,去除上清液,加入 PBS 清洗 2-3 次,每次 5 分钟。
(5) 用预温的无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞,通过荧光显微镜或流式细胞术观察。
3. 细胞贴壁染色
(1) 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
(2) 从培养基中移走盖玻片,吸出过量的培养基,将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3) 从盖玻片的一角加入100 μL 的染料工作液,轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4) 室温避光孵育 5-30 分钟。不同细胞最佳孵育时间不同,请根据具体实验需求自行摸索。
(5) 孵育结束后吸弃染料工作液,使用预温的培养液清洗盖玻片 2~3 次。
4. 显微镜检测:DHR 123 的最大激发/发射波长为 488/525 nm。
注意事项:
1)荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。