操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1、蛋白制备
1.1 为获得最佳标记效果,请制备蛋白 (抗体) 浓度为 2 mg/mL。
1.2 蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果 pH 值低于 8.0,应使用 1 M 碳酸氢钠进行调节。
1.3 如果蛋白浓度低于 2 mg/mL,标记效率会大大降低。为获得最佳标记效率,建议终蛋白浓度范围为 2-10 mg/mL。
1.4 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 的缓冲液中,并且铵离子,否则会影响标记效率。
2、染料制备
将无水 DMF 加入 5-TAMRA-SE 小瓶中,制成 10 mM 储备液。通过移液器或涡旋混合均匀。
3、染料用量的计算
反应所需的 5-TAMRA-SE 的量取决于待标记蛋白的量,5-TAMRA-SE 与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
4、运行偶联反应
4.1 将适量新鲜制备的 10 mg/mL 5-TAMRA-SE 缓慢加入到 0.5 mL 蛋白质样品中
在溶液中,轻轻摇动混匀,然后短暂离心,将样品收集在反应管底部。请勿混匀,以免蛋白样品变性失活。
4.2 将反应管置于避光处,在室温下间隔轻轻孵育 60 分钟。10-15 分钟,轻轻逆转反应
5、纯化偶联物
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物的示例。
5.1 根据制造说明准备 SepHadex G-25 柱。
5.2 将反应混合物加载到 SepHadex G-25 柱的顶部。
5.3 一旦样品在顶部树脂表面下方运行,立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
5.4 向所需样品添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。