操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果,请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5,若 pH 低于 8.0,则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL,标记效率会大大降低,为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中,否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料,制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
【注】:CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
使用前需先使用缩合液 (500 μg/mL) 活化后方可进行后续标记实验。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量,CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中,轻轻摇匀混合,然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀,防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处,在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟,每隔 10–15 分钟,将反应小管轻轻颠倒几次,以充分混合两种反应物,提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时,立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。