Propidium iodide (PI) 是一种常用的细胞核红色荧光染料，作为一种溴化乙锭 (EB) 的类似物，能够嵌入碱基之间实现与 DNA 结合。这种结合没有或者几乎无序列倾向性，大约每 4-5 个 DNA 碱基对结合一个染料。Propidium iodide 也能与 RNA 结合，需要用核酸酶处理来区分 DNA 和 RNA 染色。

染料/荧光试剂

Propidium iodide 已证明对神经元没有毒性作用，是当今最常见的膜完整性和细胞活力的标记物，在固定前使用 (预固定 Propidium iodide 染色法)。预固定染色已广泛用于定量评估急性神经变性模型中的神经元细胞衰退，可视化为退化神经元的强烈标记的 PI⁺-固缩核 ^[1]。

Propidium iodide 不能穿过活细胞的膜，因此可以通过流式细胞仪分析测量凋亡细胞的百分比。此时，Propidium iodide 当作一种 DNA 含量决定因子，处于细胞周期 G₂ 和 M 期的细胞所包含的 DNA 含量是 G₀ 和 G₁ 期细胞的两倍，S 期的 DNA 含量介于这两个含量之间。流式细胞仪数据显示与电泳和比色法获得的结果具有极好的相关性。这种新的快速、简单和可重复的方法被证明可用于评估骨髓、胸腺和淋巴结等异质组织中特定细胞群的凋亡 ^[2]。

操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改)

1. 储存液的配制

称取 1 mg Propidium iodide 粉末 (M.Wt=68.4) ，用 1 mL 去离子水充分溶解配成 1 mg/mL (1.5 mM) 的储存液。

注：储存液 4ºC 避光保存，并尽量避免反复冻融。至少 6 个月稳定。

2. 贴壁细胞复染步骤 (荧光显微镜检测)

2.1 样本准备：根据自身样本选择合适步骤固定细胞。Propidium iodide 染色一般在其它染色完成后再进行。Propidium iodide 复染要求细胞经透化处理。
2.2 RNase 酶处理：若样本使用多聚甲醛，甲醛或者戊二醛固定，则需要进行 RNase 处理。若样本用甲醇/醋酸或者丙酮固定，通常不需要此步操作。

     a：于 2×SSC (0.3 M NaCl，0.03 M sodium citrate，pH 7.0) 溶液平衡样本；

     b：将本品置于含有 100 µg/mL DNase-free RNase 的 2×SSC 溶液中 37°C 孵育 20 分钟；

     c：用 2×SSC 溶液清洗样本 3 次，每次 1 分钟。
2.3  复染：

     a：于 2×SSC (0.3 M NaCl，0.03 M sodium citrate，pH 7.0) 溶液平衡样本；

     b：直接用 2×SSC 稀释 1 mg/mL (1.5 mM) Propidium iodide 储存液 1:3000，得到 500 nM 的 Propidium iodide 工作液。通常添加 300 µL 染液足够用于一个盖玻片细胞制片。染色 1-5 分钟。

     c：2×SSC 清洗几次，流尽多余液体，加入抗淬灭剂封片。

     d：选择荧光显微镜的合适滤片进行观察。

3. 悬浮细胞复染步骤 (流式细胞仪检测)

3.1 样本准备：根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。或者使用如下的步骤：
    a：收集细胞，密度约 2×10⁵~1×10⁶。离心后吸除上清，轻弹管壁就剩下的液体重悬细胞。加入 1 mL 常温存放的 PBS；
    b：将所有的重悬细胞转移到 4 mL 于 -20ºC 预冷的无水乙醇，在高速涡旋混匀的同时一边用枪缓慢的添加细胞悬液到乙醇内。于 -20ºC 乙醇中固定 5-15 分钟。

    c：离心收集细胞，除去乙醇。轻弹管壁以弹松细胞后，加入 5 mL 室温的 PBS。允许细胞水化 15 分钟；

3.2 复染

    a：用染色液 (100 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM CaCl₂，0.5 mM MgCl_2，0.1% Nonidet^® P-40) 稀释 1 mg/mL (1.5 mM) Propidium iodide 储存液 1:500，得到 3 µM 的 Propidium iodide 工作液。1 mL 的 Propidium iodide 染色液足够用于每个细胞样本的检测。

    注：工作液的使用浓度可以根据自身实验体系调整，也可以直接使用 PBS，HBSS 等缓冲液直接稀释 Propidium iodide 储存液到需要的浓度。

    b：样本制备的最后一步后离心收集细胞，去除上清，用手轻弹管壁以弹松细胞后，加入 1 mL 的 Propidium iodide 染色工作液。室温孵育 15  分钟后，流式细胞仪进行细胞分析。若用显微镜观察，则需要离心样本，去除上清并重悬细胞在新鲜的缓冲液中。吸取 1 滴悬液到载玻片上，盖上盖玻片后观察。

4. 染色质 FISH 复染步骤

4.1 样本准备：根据标准步骤制备样本。复染之前的最后一步用去离子水清洗样本以去除玻片上残留的缓冲液。室温晾干。此步骤有助于减少非特异性的背景染色。

4.2 复染
    a：工作液的配制：用 PBS 缓冲液直接稀释 1 mg/mL (1.5 mM) 的 Propidium iodide 储存液 1:1000，得到 1.5 µM 的 Propidium iodide 染色工作液。滴加 300 µL 的工作液直接到样本。有必要的话，工作液内加入新鲜制备的 RNase A (终浓度：10 µg/mL)。可使用塑料盖玻片均匀分布染液在载玻片上。室温避光条件下孵育样本 30 分钟；如果加入 RNase 则 37ºC 孵育。

    b：去除盖玻片，用 PBS 或去离子水清洗以除去没有结合的染料；
    c：用吸水纸围绕样本周围吸取残留液体，盖上玻璃盖玻片用石蜡或指甲油封住盖玻片边缘。也可用抗荧光淬灭剂进行封片。
    d：选择荧光显微镜的合适滤片进行观察。