操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1、制备染色液
(1) 蛋白实验染色:将 Thioflavin T 溶解于 1xPBS 中,得到浓度为 1 mM 的染料工作液。
(2) 组织切片染液:将 Thioflavin T 溶解于 50% 乙醇中,得到浓度为 0.05 w/v% 的染料工作液。
2、蛋白染色
(1) 在黑色 96 孔板中使用 PBS 稀释 Thioflavin T,使每个孔中 Thioflavin T 的最终浓度为 25 μM (每孔体积 = 100 μL);
(2) 提前准备在室温下解冻 α 突触核蛋白等分试样;
(3) 将 10 μM 预成型原纤维或 100 μM 单体 (或两者) 加入适当的孔中,将孔内容物上下混合;
【注】:以上为参考浓度,实际应用中需进行预实验优化。
(4) 密封板并置于 37°C 的振荡培养箱 (600 rpm) 中;
(5) 在 1 至 72 小时内,定期使用荧光酶标仪在激发波长和发射波长分别为 450/482 nm 条件下测量荧光值。
3、组织切片染色
(1) Thioflavin T 适用于石蜡切片染色;
(2) 将处理后的切片与 Thioflavin T 在黑暗中孵育 8 分钟。请根据具体实验需求自行摸索最佳染色时间;
(3) 将切片分别在 80% 乙醇和 H2O 中洗涤两次,每次 10 秒;
(4) 使用不含 DAPI 的 抗淬灭封固剂封固,在激发波长和发射波长分别为 450/482 nm 条件下使用荧光显微镜下观察。
注意事项:
(1) 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
(2) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。