操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1、制备染色液
1. 染料储存液:使用 DMSO 将 MitoMark Red I 溶解成 1-5 mM 的储存液。配置好的储存液分装后于 -20℃ 避光保存。
2. 染料工作液:用合适的缓冲液 (如:无血清培养基,HBSS 或 PBS) 稀释储存液,配制浓度为 25-500 nM 的 MitoMark Red I 工作液。
注意:
1. MitoMark Red I 常用的工作浓度范围是 25-500 nM,建议使用相对偏低浓度进行染色。若使用更高浓度可能会染上其他细胞结构,为了降低探针加载过度可能引起的假阳性,建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
2. 对于后续需要进行固定和透化的细胞染色,建议使用工作浓度范围在100-500 nM。
3. 请根据实际情况调整及优化工作液浓度,现用现配。
2、细胞悬浮染色 (以 6 孔板为例)
1. 悬浮细胞经 1000g 离心 3-5 分钟。弃去上清液,使用 PBS 清洗两次,每次 5 分钟。
2. 贴壁细胞使用 PBS 清洗两次,加入胰酶消化细胞,消化完成后经 1000g 离心 3-5 分钟。
3. 加入 1 mL 染料工作液重悬细胞,室温避光孵育 15-45 分钟,不同细胞最佳培养时间不同。
4. 孵育结束后,经 1000g 离心 5 分钟,去除上清液,加入 PBS 清洗 2-3 次,每次 5 分钟。
5. 使用无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞,通过荧光显微镜或流式细胞技术进行观察。
3、细胞贴壁染色
1. 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
2. 从培养基中移走盖玻片,吸出过量的培养基,将盖玻片放在潮湿的环境中。
3. 从盖玻片的一角加入 100 μL 染料工作液,轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞,室温避光孵育 15-45 分钟。
4. 吸弃染料工作液,使用培养液清洗盖玻片 2~3 次,每次 5 分钟。
4、使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。MitoMark Red I 的最大激发/发射波长 578/599 nm。
注意事项:
1. 若后续步骤如 ICC 需要透化,建议使用含表面活性剂 (如 Triton X-100) 的缓冲液来透化细胞。细胞也可以用冰丙酮透化处理 5 分钟,之后用 PBS 清洗 (即使后续细胞不用进行其它抗体标记,这一丙酮透化步骤也可能改善信噪比)。
2. 细胞如需固定染色,建议使用含 2-4% 多聚甲醛的新鲜配制预热的缓冲液或培养基进行固定。
3. 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。