操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 溶液配制
1.1 储存液:用 DMSO 溶解 Rhodamine B,配置浓度为 10 mM 的储存液。
【注】:建议将未使用的储存液分装后在 -20℃ 或 -80°C 避光保存,避免反复冻融。
1.2 工作液:用实验缓冲液稀释储存液,到所需的工作浓度。
【注】:最佳的工作浓度请根据实际情况调整或参阅文献自行设置梯度浓度进行摸索。工作液必须现配现用。
2. 细胞悬浮染色 (以 6 孔板为例)
2.1 悬浮细胞经 1000g 离心 3-5 分钟。弃去上清液,使用 PBS 清洗 2 次,每次 5 分钟。
2.2 贴壁细胞使用 PBS 清洗 2 次,加入胰酶消化细胞,消化完成后经 1000g 离心 3-5 分钟。
2.3 加入1 mL Rhodamine B 工作液重悬细胞,室温避光孵育 5-30 分钟,不同细胞最佳培养时间不同。
2.4 孵育结束后,经 1000g 离心 5 分钟,去除上清液,加入 PBS 清洗 2-3 次,每次 5 分钟。
2.5 使用无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞,通过荧光显微镜或流式细胞技术进行观察。
3. 细胞贴壁染色
3.1 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
3.2 从培养基中移走盖玻片,吸出过量的培养基,将盖玻片放在潮湿的环境中。
3.3 从盖玻片的一角加入100 µL Rhodamine B 工作液,轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞,室温避光孵育 30-60 分钟。
3.4 吸弃染料工作液,使用培养液清洗盖玻片 2-3 次,每次 5 分钟。通过荧光显微镜进行观察。
4. 用 Rhodamine B 标记南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB) 步骤 [2] (来自文献,仅做参考)
4.1 在 DMSO 中制备 5 mg/mL 的 Rhodamine B 溶液,取 0.4 mL。
4.2 在 Na2CO3-NaHCO3 缓冲液 (50 mM;pH 9) 中制备 5 mg/mL 的 CALB 溶液,取 4 mL。
4.3 将 0.4 mL 的 Rhodamine B 溶液加入到 4 mL 的 CALB 溶液中,将混合物在 4°C 下搅拌 12 小时。
4.4 用 50 mM 的 NH4Cl 终止反应。
4.5 将反应混合物在 4°C 下用 PBS (50 mM;pH 7) 透析 48 小时,以去除未反应的染料。