操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)。
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 50 μL FITC 缓慢加入到 1 mL 蛋白样品溶液中,轻轻摇匀混合后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀,防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处,在室温条件下轻轻摇晃孵育 8 小时,每隔 30 分钟将反应小管轻轻颠倒几次,以充分混合两种反应物,提高标记效率。
3) 加入 5 M 的 NH4Cl 至终浓度 50 mM,4℃ 终止反应 2 小时。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案以使用 Sephadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 Sephadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 Sephadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时,立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合物含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。
注意事项
1. FITC 对光及湿度敏感。建议即用即配 FITC 溶液并丢弃未使用的部分。
2. 低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02%) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01%) 不会显著干扰蛋白标记;但是 20-50% 的甘油会降低标记效率。
3. 避免使用含伯胺 (例如 Tris,甘氨酸) 或铵离子的缓冲液,它们与待标记蛋白竞争反应。