操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 标记反应步骤
1.1 将需要标记的蛋白质用缓冲液稀释到蛋白浓度为 50-100 μM,缓冲液可为 10-100 mM 的磷酸缓冲液、Tris、HEPTES 缓冲液均可。缓冲液 pH 严格控制在 pH 6.5-7.5 之间,以保证 Cyanine7 maleimide 对巯基官能团的高选择性。
1.2 如果蛋白中的巯基是游离的,可直接进行第 3 步。如果想还原双硫键进行标记,或者活化巯基以便提高反应效率,可以向蛋白溶液中加入 10x 蛋白浓度的 TCEP,以活化巯基。如果采用 DTT或者 2-ME 活化巯基,需要透析或沉淀或凝胶分离除去还原剂。
1.3 将 Cyanine7 maleimide 染料用有机溶剂 (DMF 或者 DMSO) 稀释到 1-10 mM。取 10-20 当量的染料加入到蛋白溶液中。由于有机溶剂容易致使蛋白变性,所以反应体系中有机溶剂含量不要超过 10% (体积比)。如果染料为普通 Cy 染料,可能会有沉淀出现,这一般是由于染料的低水溶性而析出了。
1.4 反应在常温下孵育 2 小时或者 4 度过夜,孵育时可在翘班摇床上轻微摇晃,同时锡箔纸包裹避光。反应结束后,高速离心除去未溶解染料或其它沉淀物,取上清进行下一步纯化。如果蛋白质本身比较稳定,可以标记反应更长时间,甚至常温孵育过夜,以期达到最大的标记效果。
1.5 采用透析法除去未反应的染料小分子,或者用凝胶柱分离,比如 Sephadex G15 或者 G-25,除去染料分子,得染料标记蛋白。