操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 荧光光学呼吸测定法 (FOR) 实验步骤 [1]:
1.1. 将 Tris (4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)ruthenium (II) dichloride ([Ru (DPP)3]Cl2) 与硅胶混合,嵌入 2% w/w 硅橡胶,滴加 2 滴至 96 孔板,37℃ 湿盒孵育 2-3 天备用。
1.2. 体外培养目标微生物 (如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等),37℃,有氧培养 48 小时,稀释至 105-106 CFU/mL;准备试验药物,并稀释至设定浓度 (如 DMSO 2%-40%、药用植物提取物 0.08 mg/mL-166 mg/mL) 。
1.3. 向包被 [Ru (DPP)3]Cl2 的 96 孔板每孔加入 80 μL 药物样本或稀释后的药物制剂 (按 1:10、1:100、1:1000 稀释) ,再加入 80 μL 微生物悬液,表面覆盖 60 μL 矿物油;使用 Tecan Infinite 200PRO 或其他荧光酶标仪,监测相对荧光强度随时间变化,实验设 3 次重复,记录达到半最大荧光强度的时间及 MIC 值。
1.4. 以系列稀释法和琼脂平板菌落计数法为对照,验证 FOR 检测结果的一致性,同时评估药物成分对 [Ru (DPP)3]Cl2 荧光信号的干扰。
2. 肿瘤内氧成像体外实验步骤 [2]:
2.1. 制备纳米传感器 (Ru-ONPS) :将 Tris (4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)ruthenium (II) dichloride ([Ru (DPP)3]Cl2) 染料嵌入 F-127 聚合物中,用尿素和多聚甲醛交联,制备得到粒径约 64±7 nm 的纳米传感器。
2.2. 细胞与共培养球体制备:体外培养肿瘤细胞 (如 HCT-8 细胞) 和正常细胞 (如 NIH3T3 细胞) ,常规传代至对数生长期;构建肿瘤细胞共培养球体,培养至设定时间 (如 48 h、120 h、216 h) 用于氧梯度监测。
2.3. 成像与氧水平检测:将 Ru-ONPS 与肿瘤细胞或共培养球体共孵育,通过共聚焦显微镜观察传感器的细胞摄取情况及肿瘤内分布;基于 Stern-Volmer 方程,利用传感器荧光信号变化定量检测氧水平,其检测动态范围为 0-23 mg/L,检测限 10 μg/mL,记录不同时间点 (如 72 h) 细胞及共培养球体的氧含量数据。