操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 储存液的配制
本品是以粉末形式提供,使用前需将本品回温至室温。使用细胞培养级别的无水 DMSO,向 50 µg 粉末加入 36.4 µL 的 DMSO,充分溶解至终浓度 2 mM。可根据单次的使用量将储存液分装后放到 -20ºC 避光,避免反复冻融。
2. 工作液的配制
根据不同的实验目的使用不同的探针浓度,以下的起始操作条件仅作参考,可根据细胞类型和其他的相关因素如细胞或组织的透化等进行适当调整。
用适当的缓冲液 (HHBS/PBS/DPBS等) 或者无血清培养基稀释储存液至工作液浓度。例如,制备 1~20 μM 染料工作溶液,通过涡旋混合均匀。
3. 染色及检测
3.1 在培养皿/瓶内加入适量的培养基培养细胞,当细胞长至所需丰度,准备离心细胞;
3.2 离心细胞,每管大约 2-10×105 个细胞;
3.3 向细胞中加入大约 500 μL 体积、37℃ 预热的 CellTracker Red CMTPX 染色工作液,在所使用细胞正常培养条件下避光、孵育细胞 15~30 分钟,最佳孵育时间需优化;
3.4 染色结束后,吸出染料,用适量的预热缓冲溶液 (例如 PBS) 清洗细胞 2-3 次。将细胞细胞重悬于 500 μL 预热的缓冲溶液或培养基中,得到 2-10×105 个细胞;
3.5 用荧光显微镜、共聚焦显微镜、或流式细胞仪 (FL1 通道) 检测 Ex/Em = 577/602 nm 处的荧光信号变化。
【注意事项】
1. 该染料适用于贴壁细胞和悬浮细胞;
2. 对于细菌细胞染色:细菌过夜生长预处理的营养肉汤中 1: 800 稀释储备溶液时,染色是最有效的,也可以使用新鲜牛肉膏或 PBS 稀释。细菌悬浮液可以用 PBS 稀释至每毫升 105-107个生物。可以将 1 mL 细菌溶液加到 0.45 μm 过滤器 (25 mm) 并真空过滤除去溶液,然后加入 1 mL 染料溶液并在室温下孵育 5-10 分钟染色细菌。