操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改) [2]
1. 溶液配制
1.1 储存液:用 DMSO 溶解 NADA-green,配制 10 mM 母液。
【注】:未使用的储存液分装后在 -20℃ 或 -80°C 避光保存,避免反复冻融。
1.2 工作液:用实验缓冲液稀释母液到所需的工作浓度,例如:25 μM。
【注】:最佳的工作浓度请根据实际情况调整或参阅文献自行设置梯度浓度进行摸索。工作液必须现配现用。
2. 用 NADA-green 标记细胞壁 (来自文献,仅做参考)
2.1 当培养物 OD600 达到 0.8 时,取 500 µL 样品,离心收集细胞,弃上清。
2.2 将细胞沉淀重悬于 150 µL 新鲜培养基,加入 25 µM NADA-green 染料,37°C 摇床避光孵育10 min。离心收集细胞,弃上清。
2.3 用 200 µL PBS 轻柔洗涤 1 次,去除未结合染料,重悬于 150 µL 新鲜培养基中备用。
2.4 取标记后的细胞悬液,离心并用 200 µL PBS 再次洗涤,彻底去除培养基成分。重悬细胞于 50 µL PBS,取 1 µL 滴加至覆盖 1.2% 琼脂糖薄层 (预浸于 PBS) 的载玻片上,轻压盖玻片固定。
2.5 使用结构光照明显微成像 (SIM) 在 488 nm 处对 NADA-green 进行成像,曝光时间为 30 ms。