操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
Cy5-DBCO标记细胞与示踪的方法 [5]
1. 试剂准备:将四乙酰化的N-叠氮乙酰基-D-甘露糖胺 (Ac4ManNAz) 溶解于完全细胞培养基中,配制成 50 μM 的工作浓度;将 Cy5-DBCO 溶解于合适的缓冲液 (DPBS,pH=7.4) 中,配制成工作浓度 (体外实验 20 μM,体内注射 25 μM)。
2. 靶细胞叠氮标记:将目标细胞 (A549、KB、U87MG 等) 以适当密度接种,在含有 50 μM Ac4ManNAz 的完全培养基中培养 3 天。
3. Cy5-DBCO 标记与检测(体外):
将经过 Ac4ManNAz 处理的细胞用 DPBS (pH=7.4) 洗涤两次,加入 Cy5-DBCO 工作液 (20 μM),在 37°C 下孵育 1 小时。用 DPBS 充分洗涤细胞。对细胞进行固定 (甲醛-戊二醛混合固定液)、核染色 (DAPI),使用共聚焦激光扫描显微镜 (Ex=635 nm,Em=650-700 nm) 进行荧光成像分析。也可用流式细胞术进行定量分析。
4. Cy5-DBCO 标记与检测(体内):
将经过 Ac4ManNAz 处理 3 天的靶细胞直接注射到活体动物的靶器官;细胞移植 3 天后,通过尾静脉向小鼠体内注射 Cy5-DBCO 溶液 (25 μM,200 μL);探针注射后 4 小时,利用活体成像系统对动物进行全身荧光成像,观察靶器官处的特异性荧光信号。也可解剖器官,使用荧光成像系统进行离体成像或制作冰冻切片进行显微观察。
注意事项:
1. 未与细胞表面叠氮基团反应的游离 Cy5-DBCO 主要通过肾脏途径在注射后 4 小时内被清除,有助于降低背景信号。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
本实验方案根据研究内容整理,仅供参考,请根据实际需求进行调整