5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) 是一种胺活性衍生物的荧光染料，具有广泛的应用，作为抗体和其他探针标记，用荧光显微镜，流式细胞仪、免疫荧光方法如 ELISA 和 Western 印迹实验。该产品在溶液状态不稳定，建议现用现配，并在短期内尽快用完。

5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) 是一种胺反应性荧光探针 ^[1][2]。

5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) 与胺基反应形成与蛋白质的偶联物，用于各种基于荧光的应用。FITC 的激发/发射最大值分别为 485/535 nm ^[2]。

操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改)

储存液制备 ^[3]
在丙酮或 DMSO 中制备 1 mg/mL 5(6)-FITC 储备溶液，并储存于 0℃。
工作液制备：在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中制备 2.5 pg/mL，PH 调至 7.8。
 

5(6)-FITC 用于流式细胞术检测 ^[3]
(1) 细胞准备：用 10 mL PBS 将细胞从固体营养琼脂板上洗净，在 2000 g 下离心 30 分钟，然后用 10 mL 70% 乙醇重悬，4℃ 孵育。
(2) 染色：取 3×10⁵ 细胞并离心，将细胞在 2.5 pg/mL 的 5(6)-FITC 中重悬，在 4℃ 下染色 45 分钟。
(3) 上机：用流式细胞仪进行检测绿色荧光的比例。
 

5(6)-FITC 用于蛋白酶测定 ^[4]
(1) 将 1 g 酪蛋白溶解在 100 mL 的溶液中，该溶液含有 50 mM 碳酸钙和 150 mM 氯化钠，pH值为 9.5。可以先将溶液加热至沸腾，然后冷却至室温。
(2) 加入 40 mg 5(6)-FITC，室温下轻轻搅拌 1 h。
(3) 通过透析去除游离的 5(6)-FITC，首先在 4°C 下用 2 L 含活性炭的水透析，然后用 pH 8.5 的 50 Mm Tris 缓冲液透析，最后用 pH 7.2 的 50 mM Tris 缓冲液透析。
(4) 使用 pH 7.2 的 50 mM Tris 缓冲液将蛋白质浓度调整为 0.5%。底物分装成 5 mL 每份，冷冻保存在 -20°C，可稳定保存 1 年。
(5) 通过测量底物在 490 nm 处的吸光度，使用 Lowry 法测量蛋白质含量，确定每个酪蛋白分子上有 0.65 个 FITC 残基。
(6) 使用 FTC-酪蛋白进行反应。反应混合物包含 10 μL 酶、20 μL 测定缓冲液和 20 μL 0.5% 的 FITC-酪蛋白。
(7) 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.8 的 100 mMTris 缓冲液，含 10 mM CaCl2; 或 pH 7.8 的 100 mM 磷酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(8) 枯草杆菌蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.6 的 20 mM 磷酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(9) 热稳定性蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.8 的 100mM Tris 缓冲液，含 10 mM CaCl2。
(10) 弹性蛋白酶：测定缓冲液为 pH 8.8 的 20 mM 硼酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(11) 充分混合后，将溶液在 37℃ 摇床水浴中孵育 5 min 至 24 h。孵育大于 3 h 可加入 0.2% 叠氮化钠防止细菌生长。
(12) 反应通过加入 120μL 5% 三氯乙酸 (TCA) 并充分混合来终止。试管在室温下静置至少 1 小时。将试管回收并在 4°C 下过夜保存。通过离心 5 分钟,沉淀 TCA 不溶性蛋白质。取上清液 60 μL，用 pH 8.5 的 500 mM Tris 缓冲液稀释至 400 μL 或 3 mL，并充分混合以确保整个样品达到适当的 pH 值。
(13) 荧光测定使用激发波长 365 nm 或 490 nm，发射波长 525 nm。重复测量的平均值。使用单个值计算相关系数 r 和回归线的标准误差 S。
(14) 胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和热稳定性蛋白酶对 FTC-酪蛋白的裂解与酶浓度呈线性关系。
 

免疫荧光检测血小板上 FITC 标记抗体 ^[5]
(1) 富血小板血浆 (PRP) 制备：将血液在 22°C 下以 180 × g 离心 8 分钟，分离出富血小板血浆。
(2) 血小板收集: 将 PRP 在 22°C 下以 1800 × g 离心 10 分钟，收集血小板。红细胞和白细胞的污染少于 0.5%。
(3) 血小板洗涤: 用 PBS 在 22°C 下以 1800 × g 离心 10 分钟洗涤血小板两次，然后将血小板重悬于 PBS 中。
(4) 纯化人 IgG: 人 IgG 通过 DEAE 纤维素层析从正常人血清中纯化。
(5) 使用 FITC 标记的山羊抗人 IgG 抗体: 总蛋白浓度为 6.2 mg/mL，荧光素/蛋白摩尔比为 2.6，特异性抗体浓度为 1.6 mg/mL。
(6) 将 FITC 标记的抗人 IgG 山羊抗体加入到含有 8.0 × 10⁸ 个细胞 /mL 的 0.5 mL 血小板悬浮液中，最终浓度为 1.0 × 10^-7M。在 22°C 下孵育 20 分钟后，用 PBS 洗涤血小板两次并重悬于 PBS 中。然后加入 SDS (1.5 mg/mL)，并通过荧光法测定结合的抗人 IgG 抗体，激发波长为 493 nm，发射波长为 516 nm。
 

注意事项
1. 5(6)-FITC 对光及湿度敏感。即用即配 5(6)-FITC 溶液并丢弃未使用的部分。
2. 低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02％) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01％) 不会显著干扰蛋白标记；但是 20-50％ 的甘油会降低标记效率。
3. 避免使用含伯胺 (例如 Tris，甘氨酸) 或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白竞争反应。
4. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。