操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
Tetrazolium Red 对缺血区域大小的染色 [1]:
1. 人脐带间充质干细胞 (HUMSCs) 的制备
HUMSCs 从婴儿身上分离出来,并在 37℃ 的 DMEM 中以 10% 的胎牛血清培养。
2. 动物手术
大鼠被氯胺酮麻醉 (400 mg/kg,腹腔注射),进行大脑中动脉闭塞 (MCAO) 手术和再灌注。
注意:在 MCAO 手术中,在右眼眶钻孔以暴露右侧大脑中动脉。动脉在同时夹住两条颈动脉的情况下被结扎 90 分钟,之后移除结扎线和夹子以恢复血流。
3. HUMSCs 的移植
在 MCAO 后 24 小时,通过两次注射将总计 5x105 个 HUMSCs 移植到每只大鼠的缺血皮层中。
4. 缺血皮层的识别
大鼠被深度麻醉并断头。大脑的冠状切片被切成 2 mm 厚,浸泡在 2% Tetrazolium Red 中,然后用 10% 福尔马林固定。
5. 数据分析 (数字图像)
缺血区域的大小,即没有红色染色的区域,使用 ImagePro 软件在数字图像上进行测定。
Tetrazolium Red 染色细胞增殖和活力测量 [2]:
1. 准备:2-5 mg/mL Tetrazolium Red 溶于 PBS 中。
2. 用血细胞计数板手动计数分离的细胞,然后将不同浓度 (5x104 到 1x106) 的细胞接种到 24 孔培养板中,加入 1 mL 对照培养基,然后放回温箱中,让细胞再附着在塑料培养板上,培养 24 小时。
3. 第二天,去掉培养基,给细胞添加 1 mL 新培养基,然后每个孔加入 200 mL 的 5 mg/mL Tetrazolium Red,使最终浓度为 0.83 mg/mL Tetrazolium Red。将培养板放回温箱 (37℃) 培养 4 小时。
去掉培养基后,每个孔中加入 1 mL 异丙醇以溶解甲臜晶体。在 570 nm 处测量光密度。
Tetrazolium Red 对脑损伤以及梗塞区域的大小的染色 [3]:
1. 对于脂多糖 (LPS) 敏感的新生儿大脑缺氧缺血 (HI),LPS (0.3 mg/kg) 在缺氧缺血 (HI) 前 72 小时通过腹腔注射给 5 天大的CD1 小鼠。在出生后第 8 天,使用 2% 的 isoflurane 麻醉小鼠,并对右侧颈动脉进行永久结扎。小鼠在此后恢复 1.5 小时,然后在一个含有 10% 氧气和 90% 氮气的玻璃腔室中暴露于 37℃ 的水浴中的缺氧环境下。缺氧暴露后,小鼠被送回动物护理设施与母鼠在一起。体内 Tetrazolium Red 标记程序在恢复 48 小时后进行。
2. 在 37℃ 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中制备的甘露醇 (0.5 M-1.4M) 通过腹腔注射给动物 (约 0.1 mL/g 体重),持续时间从 5 分钟到 180 分钟,以破坏血脑屏障 (BBB)。小鼠用 avertin 麻醉,然后用 PBS 进行心脏灌注,之后灌注 10 mL 的 2% Tetrazolium Red。在心脏灌注 Tetrazolium Red 后 10 分钟,动物的大脑被取出并放入 4% 的多聚甲醛中。提取的大脑还可以在温暖的磷酸盐盐水缓冲液 (PBS) 中孵育 30 分钟,以增强 Tetrazolium Red 染色。将大脑取出并分为对侧 (左侧皮层) 和损伤侧 (右侧皮层) 以进行蛋白质提取。
3. 数据分析 (数字图像):脑损伤以梗塞区域 (白区) 与未受损的对侧半球区域的比例表示。