操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
Tetrazolium Red 对缺血区域大小的染色 [1]:
1. 人脐带间充质干细胞 (HUMSCs) 的制备
HUMSCs 从婴儿身上分离出来,并在 37℃ 的 DMEM 中以 10% 的胎牛血清培养。
2. 动物手术
大鼠被氯胺酮麻醉 (400 mg/kg,腹腔注射),进行大脑中动脉闭塞 (MCAO) 手术和再灌注。
注意:在 MCAO 手术中,在右眼眶钻孔以暴露右侧大脑中动脉。动脉在同时夹住两条颈动脉的情况下被结扎 90 分钟,之后移除结扎线和夹子以恢复血流。
3. HUMSCs 的移植
在 MCAO 后 24 小时,通过两次注射将总计 5x105 个 HUMSCs 移植到每只大鼠的缺血皮层中。
4. 缺血皮层的识别
大鼠被深度麻醉并断头。大脑的冠状切片被切成 2 mm 厚,浸泡在 2% Tetrazolium Red 中,然后用 10% 福尔马林固定。
5. 数据分析 (数字图像)
缺血区域的大小,即没有红色染色的区域,使用 ImagePro 软件在数字图像上进行测定。
Tetrazolium Red 染色细胞增殖和活力测量 [2]:
1. 准备:2-5 mg/mL Tetrazolium Red 溶于 PBS 中。
2. 用血细胞计数板手动计数分离的细胞,然后将不同浓度 (5x104 到 1x106) 的细胞接种到 24 孔培养板中,加入 1 mL 对照培养基,然后放回温箱中,让细胞再附着在塑料培养板上,培养 24 小时。
3. 第二天,去掉培养基,给细胞添加 1 mL 新培养基,然后每个孔加入 200 mL 的 5 mg/mL Tetrazolium Red,使最终浓度为 0.83 mg/mL Tetrazolium Red。将培养板放回温箱 (37℃) 培养 4 小时。
去掉培养基后,每个孔中加入 1 mL 异丙醇以溶解甲臜晶体。在 570 nm 处测量光密度。