操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
脂质纳米粒子的制备 [3][4]
1. 试剂制备:
将 SM-102 溶解于乙醇中,配制成 10 mg/mL 的储备溶液;胆固醇、DSPC 和 DMG-PEG 2000 分别溶解于无水乙醇中;将 mRNA 溶解于 50 mM 柠檬酸钠缓冲液中 (pH=4.0);若需标记 LNPs,将 DiD 荧光探针加入脂质的乙醇溶液中,浓度为 0.2%。
2. 脂质纳米粒子制备:
每毫升脂质混合物添加 572 μL 10 mg/mL SM-102、240 μL 10 mg/mL 胆固醇、127 μL 10 mg/mL DSPC 和 61 μL DMG-PEG 2000。充分混合溶液以获得澄清溶液。此混合物含有 10 mg 总脂质。脂质摩尔比为 SM-102:胆固醇:DSPC:DMG-PEG=50:38.5:10:1.5。
3. mRNA 与 LNPs 混合:
RNA 与脂质的重量比为 0.05 (wt/wt),可通过以下三种方法进行快速混合:移液器混合法、涡旋混合法和微流体混合法。
3.1 移液器混合方法:
(1) 吸取 3 mL mRNA 溶液,快速加入 1 mL 脂质混合物溶液中 (一般采用 1:3 的乙醇脂质混合物与水性缓冲液比例)。快速上下移液 20-30 秒。
(2) 将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。
(3) 混合后,将 LNPs 用 PBS (pH 7.4) 透析 2 小时,用 0.2 μm 过滤器无菌过滤,并在 4°C 下储存。
3.2 涡旋混合法:
(1) 在涡旋混合器上以中等速度涡旋 3 mL mRNA 溶液。然后,快速将 1 mL 脂质混合物溶液加入涡旋溶液中 (通常使用 1:3 的乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例)。继续涡旋所得分散液 20-30 秒。
(2) 将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。
(3) 混合后,将 LNPs 用 PBS (pH 7.4) 透析 2 小时,用 0.2 μm 过滤器无菌过滤,并在 4°C 下储存。
3.3 微流体混合方法:
(1) 将 3 mL mRNA 缓冲液与 1 mL 脂质混合物溶液在微流控装置中以 12 mL/分钟的总流速混合 (一般采用 1:3 的乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例)。
(2) 混合后,将 LNPs 用 PBS (pH 7.4) 透析 2 小时,用 0.2 μm 过滤器无菌过滤,并在 4°C 下储存。
【注意】移液器混合法和涡旋混合法可能会产生更多异质性 LNP,包封效率较低,并且容易产生变异。微流体装置能够以高度可控、可重复的方式快速混合,从而实现均质 LNP 和高包封效率。在这些装置中,乙醇脂质混合物和水溶液在单独的流中快速混合。当两股流混合时形成 LNP,然后收集到单个收集管中。