操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 蛋白制备
1) 为获得最佳标记效果,请制备蛋白 (抗体) 浓度为 2 mg/mL。
2) 蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果 pH 值低于 8.0,应使用 1M 碳酸氢钠进行调节。
3) 如果蛋白浓度低于 2 mg/mL,标记效率会大大降低。为获得最佳标记效率,建议终蛋白浓度范围为 2-10 mg/mL。
4) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 的缓冲液中,并且铵离子,否则会影响标记效率。
2. 染料制备 (以 CY3-NHS 酯为例)
将无水 DMSO 加入 CY3-NHS 酯小瓶中,制成 10 mM 储备液。通过移液器或涡旋混合均匀。
3. 染料用量的计算
反应所需的 CY3-NHS 酯的量取决于待标记蛋白的量,以及 CY3-NHS 的最佳摩尔比约为10。
Example:假设所需的 marker protein 为 500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY3-NHS ester,得到所需的 CY3-NHS ester 体积为 5.05 μL,详细计算过程如下:
1) mmol (IgG) =mg/mL (IgG) ×mL (IgG)/MW (IgG) =2 mg/mL × 0.5 mL/150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (CY3-NHS酯) =mmol (IgG) × 10=6.7×10-6 mmol×10=6.7 × 10-5 mmol
3) uL (CY3-NHS 酯) =mmol (CY3-NHS 酯) ×MW (CY3-NHS 酯)/mg/μL (CY3-NHS 酯) =6.7 ×10-5 mmol ×753.88 mg/mmol/0.01 mg/μL=5.05 μL (CY3-NHS 酯)
4. 运行偶联反应
1) 将适量新鲜制备的 10 mg/mL CY3-NHS 酯缓慢加入到 0.5 mL 蛋白质样品中,在溶液中,轻轻摇动混匀,然后短暂离心,将样品收集在反应管底部。请勿混匀,以免蛋白样品变性失活。
2) 将反应管置于避光处,在室温下间隔轻轻孵育 60 分钟。10-15 分钟,轻轻逆转反应。
5. 纯化偶联物
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物的示例。
1) 根据制造说明准备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物 (来自“Run conjugation reaction”) 加载到 SepHadex G-25 柱的顶部。
3) 一旦样品在顶部树脂表面下方运行,立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。