HPF (Hydroxyphenyl Fluorescein) 是一种稳定的 ROS 荧光探针染料，比 H2DCFDA 的特异性与稳定性强。HPF 通过羟基自由基，与细胞内过氧亚硝基反应，可产生强烈的绿色荧光。HPF 可应用于荧光显微镜、高通量成像仪、荧光酶标仪或流式细胞仪。

有许多荧光试剂，例如2,7-二氯二氢荧光素（DCDHF），可用于检测自由基，但是它们容易被光氧化以及许多非自由基氧化剂（例如过氧化氢）氧化，因此存在很大的局限性。而 HP F仅被高活性氧（hROS）氧化，例如氢氧自由基，过氧亚硝酸盐和过氧化物酶/ H₂O₂系统产生的 hROS。该化合物对其他活性氧（ROS），例如次氯酸盐，单线态氧，超氧化物，过氧化氢，一氧化氮和烷基过氧化物几乎没有活性。

HPF 本身没有荧光，当与 hROS（如羟基自由基和过亚硝酸盐）反应被氧化后，HPF 转换为高荧光分子荧光素，激发/发射最大值分别为 490/515 nm。

HPF 是一种细胞可渗透的，光稳定的羟苯基荧光素，可作为检测高活性氧（hROS）的高度灵敏的荧光探针 ^[1]。

由于 HPF 不会与一氧化氮，超氧化物和过氧化氢反应，因此可以与一氧化氮和超氧化物区分开来检测亚硝酸盐。由于HPF不与次氯酸盐（-OCl）反应，因此可以与检测-OCl的 APF（氨基苯基荧光素）结合使用 ^[2]。

在IR (电离辐射) 前 20 min，给药小鼠腹腔内注射 HPF 探针(15 μl, 25 μM)。通过 HPF 氧化形式发出的荧光信号来评估 •OH 的积累 ^[3]。

操作指南（以下是SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改）。

1. HPF 工作液的配制

1.1 制备储存液

将低温保存的1 mg 粉末于室温回温至少 20 min，之后加入471 μL 无水 DMF 配置成 5 mM 储存液。充分溶解和混匀后，按照单次量分装，-20°C避光干燥保存,避免反复冻融。
[注 1] : HPF 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
[注 2]:  HPF 能溶于DMSO (10 mM)，但有数据显示 DMSO 是羟基自基的淬灭剂，会干扰检测和降低灵敏性。因此，建议用 DMF 作为溶剂。与 DMSO 相比，DMF 的细胞毒性相对较高，建议用户在使用过程中，在达到理想荧光信号的前提下使用最低浓度的探针。如果待检细胞在培养的过程中就发现比较敏感 (或不好培养)，建议在使用 HPF 之前，先做一组溶剂对照组来观察细胞对 DMF 的敏感程度。

1.2 工作液的配制

取一管 HPF 储存液置于室温回温，使其充分融解。然后用预热好的缓冲液（比如 HHBS 缓冲液, PBS缓冲液）稀释储存液，配制成 1-10 μM 的 HPF 工作液。

[注]：请根据实际情况调整 HPF 工作液浓度，且现用现配。

2. 细胞体系检测

以下实验步骤仅做参考，最佳的工作浓度、孵育时间和温度需根据实际情况进行调整。在加入HPF工作液之前按需处理细胞。

2.1 根据具体用量， 将 HPF的 DMF 储存液用 HHBS缓冲液或其他生理缓冲液（pH 7.0-7.5，比如：含钙镁的PBS，无酚红培养基）稀释成1-10 μM工作液。

2.2 根据实验设计处理细胞 (比如，RASM 细胞用 50- 100 nM 血管紧张素II处理 3-5 小时)。

2.3 取步骤 2.1 准备的 1-10 μM 的 HPF工作液加入细胞，4-37°C孵育 20-60 min。

2.4 吸掉染色工作液，用 HHBS 或其他生理缓冲液清洗去除多余的探针。之后替换为新鲜的生理缓冲液或培养基。

2.5 用合适的荧光仪器 (Ex/Em=490/515 nm) 来检测。

[注 1] : BSA、酚红、胺类化合物可能会影响荧光，需谨慎使用。
[注 2] : HPF 和 APF 能用于溶液体系或胞内 ROS 检测。