FerroOrange (Fe²⁺ indicator) 是一种活细胞亚铁离子 Fe²⁺ 检测荧光探针，不适用于死细胞。FerroOrange 定位在内质网，在遇到二价铁离子时，会发出不可逆的橙色荧光，最大激发光/发射光波长为 543/580 nm。FerroOrange 与 Fe²⁺ 反应后的荧光强度上升不可逆，可用荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等进行检测。铁是生物体内含量最丰富的过渡金属元素之一，参与多种生理过程活动。近年来，研究者广泛关注活细胞内游离铁的存在，游离铁以稳定的氧化还原态形式存在，主要为亚铁离子 (Fe²⁺) 和铁离子 (Fe³⁺)。在研究细胞内的还原环境、金属转运蛋白和 Fe²⁺ 的水溶性等方面，了解 Fe²⁺ 的机制比 Fe³⁺ 更为重要。

操作指南（以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改)

1. 溶液配制

1.1 从冰箱取出 FerroOrange，置于室温解冻，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

1.2 往一管 FerroOrange (24 μg) 内加入 35 μL DMSO，用枪反复吹吸混匀，使其完全溶解制备 1 mM FerroOrange 储存液。若单次不能用完储存液，请分装并置于 -20℃ 避光保存，一个月内使用。

1.3 于正式实验前，用中性缓冲液或无血清培养基来稀释 1 mM FerroOrange 储存液到所需工作浓度 (比如: 1 μM)，工作液需现配现用，尽快用完。【注】酸性溶液会氧化 FerroOrange，严重影响探针的效率。

2. 荧光显微镜操作方法

2.1. 细胞接种于荧光培养皿中，在 37℃，5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。

2.2. 弃去上清液，并用 HBSS 或无血清培养基洗涤细胞 3 次。

2.3. 更换含有药物的培养基，在 37℃，5% CO₂ 培养箱中孵育。

【注】请根据药物特性优化孵育时间。

2.4. 加入浓度为 1 μM 的 FerroOrange 工作液，在 37℃，5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟。

【注】加入 FerroOrange 染色剂后直接观察，不要洗涤。

2.5. 在荧光显微镜下观察细胞。

3. 流式细胞仪操作方法

3.1 将 1 x 10⁵个 HeLa 细胞 (MEM 培养基，含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素) 接种到 6 孔板中，并在 37℃、5% CO₂ 孵育箱中培养过夜。

3.2 用无血清培养基 (2 mL) 三次洗涤细胞。

3.3 向对照组细胞中加入无血清培养基 (1 mL)，硫酸铵亚铁处理组加入10 mM 的硫酸铵亚铁(10 μL) (最终浓度：100 μM) 的无血清培养基。

3.4 在 37℃ 孵育箱中孵育细胞 20 分钟，并用 HBSS (1 mL) 三次洗涤细胞。

3.5 经胰蛋白酶消化 (250 µL) 后，用含血清的培养基 (1 mL) 停止反应，将 1.25 mL 的细胞悬液转移到微离心管中。

3.6 将细胞悬液以 1500 转/分的速度离心 3 分钟。

3.7 丢弃上清液，并向微离心管中加入 HBSS (1 mL)，通过振荡混合。

3.8 将细胞悬液以 1500 转/分的速度离心 3 分钟，并丢弃上清液。

3.9 向细胞中加入 1 μM 的 FerroOrange 和无血清培养基的 MEM (300 μL)。

3.10 在 37℃ 孵育箱中孵育细胞 15-30 分钟。

3.11 染色细胞经过细胞过滤器过滤，并使用流式细胞仪分析样本。

4. 荧光检测

4.1 对于荧光显微镜:通用的 G 激发滤片比如 Cv3 检测用的滤片。

4.2 对于激光显微镜和流式细胞仪: 532 nm、514 nm 或 561 nm 激光器用于激发。实在没有，亦可用 488 nm 激光器。发射波长为 580 nm。

5. 荧光酶标仪操作方法

5.1 进行组别设置

样品 1：无添加剂 (仅 HeLa 细胞)。

样品 2：添加了铁螯合试剂 2,2`-bipyridyl (Bpy) 的 HeLa 细胞。

样品 3：添加铁 (硫酸铵铁) 的 HeLa 细胞。

5.2 在 96 孔黑板 (透明底) 上接种 100 µL HeLa 细胞悬液，使其达到 10000 cells/well，在 37℃，5% CO₂ 培养箱中过夜培养。

5.3 样品 3 的细胞用 MEM (不含 FBS) 100 µL 洗涤 3 次。

5.4 向样品 3 中添加 100 µL 硫酸铵铁 (II)/MEM (不含 FBS) (最终浓度: 100 µM)，在 37℃  5% CO₂ 培养箱中静置 30 分钟。

5.5 用 100 µL HBSS 洗涤所有孔的细胞 3 次。

5.6 向样品 1 和 3 中添加 100 µL 的 1 µM FerroOrange 工作液，向样品 2 中添加 100 µL 含有 FerroOrange (最终浓度: 1 µM) 和 Bpy (最终浓度: 100 µM) 的 HBSS 溶液，在 37℃，5% CO₂ 培养箱中培养 30 分钟。

5.7 用多功能读板器检测各样品的荧光强度 (Ex: 543 nm，Em: 580 nm)。